動(dòng)物基因組DNA的提取

實(shí)驗(yàn)簡介

    DNA是遺傳信息的載體，是重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對象，為了進(jìn)行測序、雜交、基因表達(dá)、文庫構(gòu)建等實(shí)驗(yàn)，獲得高分子量和高純度的基因組DNA是非常重要的前提，因此基因組DNA的提取也是分子生物學(xué)試驗(yàn)技術(shù)中重要、基本的操作之一。

實(shí)驗(yàn)原理、目的

    DNA是遺傳信息的載體，是重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對象，為了進(jìn)行測序、雜交、基因表達(dá)、文庫構(gòu)建等實(shí)驗(yàn)，獲得高分子量和高純度的基因組DNA是非常重要的前提，因此基因組DNA的提取也是分子生物學(xué)試驗(yàn)技術(shù)中重要、基本的操作之一。 染色體存在于細(xì)胞核中，外有核膜及胞膜。從組織中提取DNA必須先將組織分散成單個(gè)細(xì)胞，然后破碎胞膜及核膜，使染色體釋放出來，同時(shí)去除與DNA結(jié)合的組蛋白及非組蛋白。 整個(gè)實(shí)驗(yàn)可分為細(xì)胞裂解、DNA分離與純化和DNA的洗脫收集。

實(shí)驗(yàn)步驟

     1、取新鮮或冰凍動(dòng)物組織塊0.1g（0.5cm3），盡量剪碎。置于玻璃勻漿器中，加入1ml的細(xì)胞裂解緩沖液勻漿不見組織塊，轉(zhuǎn)入1.5ml 離心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μl，混勻。在65℃恒溫水浴鍋中水浴30min，也可轉(zhuǎn)入37℃水浴12～24h，間歇振蕩離心管數(shù)次。于臺(tái)式離心機(jī)以12000 rpm離心5min，取上清液入另一離心管中。

     2、加2倍體積異丙醇，倒轉(zhuǎn)混勻后，可以看見絲狀物，用100ul 吸頭挑出，涼干，用200ul TE 重新溶解。（可進(jìn)行PCR反應(yīng)等，需要進(jìn)一步純化的按下列步驟進(jìn)行）

     3、加等量的酚：氯仿：異戊醇振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。

     4、取上層溶液另一管，加入等體積的氯仿?異戊醇，振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。

     5、取上層溶液另一管，加入1/2體積的7.5mol/L乙酸氨加入2倍體積的無水乙醇，混勻后室溫沉淀2min ，離心12000 rpm ,10min。

     6、小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉。

     7、用1ml 70%乙醇洗滌沉淀物1次，離心12000 rpm ， 5min。

     8、小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉，室溫干燥。

     9、加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存?zhèn)溆谩?/span>

     10、吸取適量樣品于GeneQuant上檢測濃度和純度。

常見問題

1、盡量簡化操作步驟，縮短提取過程。

2、減少化學(xué)因素對核酸的降解。

3、減少物理因素對核酸的降解：機(jī)械剪切力和高溫。

4、防止核酸的生物降解：排除核酸酶。